image j灰度值分析教程（wb条带灰度分析及数据处理）
2022-03-24
伤口愈合实验（Wound healing assay）是一种操作简单、经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法，在SCI论文中得到了广泛的使用【1】。
如何分析划痕实验结果却令很多人头疼！划痕实验常见的统计指标是统计伤口愈合百分比（Wound healing percentage）和划痕宽度。伤口愈合百分比本质上是一种面积分析，半夏在往期已经给大家分享过30秒搞定划痕面积分析，有兴趣的童鞋可以自行查看！
划痕面积的基本分析步骤为：对划痕图片进行Process -> Smooth平滑后进行Process -> Find Edges寻找边缘，再使用Image -> Adjust -> Threshold，阈值选定后进行划痕面积分析：
划痕面积的分析相信大家已经很熟悉了，然而使用ImageJ分析实验划痕宽度却困难重重！在网络上我注意到有很多人都对划痕宽度计算心存疑惑：
关于宽度计算目前常用的方法是使用Plugins -> Analyze -> Grid添加等距的水平线（Horizontal lines）或是垂线，再沿着水平线或是垂直线手动画出划痕宽度，再使用Analyze -> Measure进行计算：
这种方法存在缺点：
手动画线起点和终点欠精确；添加的等距水平线数量有限，得到的平均宽度不准确；工作量大，浪费时间。
01、基础知识准备
(1)灰度值灰度值纯黑为0、纯白为255：
（2）Plot Profile
Plot Profile（快捷键 Ctrl+K）见于Analyze -> Plot Profile，适用于线和矩形选框，表示线段和矩形选框所经过的范围内的灰度变化（荧光强度），如下图：
Plot Profile常用于定性表示荧光共定位【2】与矩形范围内荧光强度变化【3】：
02、划痕宽度分析
（1）划痕面积分析
1. ImageJ打开待分析划痕图片，先通过Image -> Type -> 8-bit将图片格式转化为8-bit灰度图片，再通过Process -> Smooth将图片进行平滑处理，最后点击Process -> Find Edges寻找边缘：
2. Process -> Filters -> Gaussian Blur…Sigma设为6，对图片进行模糊处理：
3. Image -> Adjust -> Threshold，按照自己需要调整适合的阈值，调整合适后点击Apply：
此时得到的图片黑色灰度值为0，白色灰度值为255。
4. 使用魔棒工具选择划痕，Edit -> Clear清除划痕内部的细胞，然后使用Edit -> Clear outside去除非划痕部分的白色空隙。Edit -> Invert将划痕转变为灰色，再次对整张图片进行反转，得到划痕为白色、非划痕部分为黑色：
5. 验证所得划痕面积的准确性
利用魔术棒点击白色区域，点击Analyze -> Tools -> ROI Manager…-> Add，打开原图片，点击ROI Manager中刚刚Add的区域，此区域将会显示在原图片中，通过符合程度返回第3步调整阈值，调整目的区域：
（2）划痕宽度计算1. 将得到上步骤得到黑白划痕图片使用Image -> Transform -> Rotate 90 Degrees Right/Left进行旋转：
2. Edit -> Selection -> Select All全选整个图片。点击Analyze -> Plot Profile，再点击结果左下角的List，点击新弹出窗口中Edit -> Copy，复制所有数据，粘贴至新建Excel中：
3. 划痕宽度分析思路
Plot Profile得到的Gray value变化是整张图片从左往右对应的每个高度的灰度值的平均值。黑色灰度值为0，白色灰度值（代表划痕）为255，仅有白色范围可以影响平均灰度值。
示例划痕图片长宽为460*500 pixels，则有460条竖直线覆盖图片，下图X为竖直线编号。划痕宽度乘以255除以500即对应平均灰度值。反之利用利用公式：(Y*500)/255就可以得到整条线上白色的区域的长度（500为一条线的总长度），也就是划痕宽度：
进一步可以求每张划痕的平均宽度。值得注意的是，本次计算划痕宽度没有进行标尺校正操作，故得到的宽度单位为像素。在Analyze -> Set Scale进行标尺校正后可以得到其实际距离。
最后，检查一下所求宽度是否和实际相符：
03、总结
利用对二值化图片进行Plot Profile操作，我们便捷、准确的获取了划痕对应的每一个像素的宽度，这提示我们在日常的科研生活中应该勤于思考、做到举一反三！今天的给大家分享ImageJ高效分析划痕宽度就到此为止了，希望对大家有所帮助！
在科研界的江湖中，流传着一大神器—— ImageJ，堪称数据图像分析处理的“倚天剑”。